Ускоряем R&D в фармацевтике
Предсказание и исследование метаболитов малых молекул
Лекарственные средства в организме человека могут образовывать активные и реактивные метаболиты, вызывающие неожиданные фармакологические эффекты или потенциальную токсичность. Руководство FDA рекомендует проведение исследований профиля метаболитов in vitro на ранних стадиях разработки лекарств.

НИИ ХимРар осуществляет поиск и предсказание метаболитов малых молекул с помощью ВЭЖХ-МС/МС метода. Для определения профиля метаболитов используется полная панель in vitro тестов.

Последовательность выполнения работ

1. Определение стабильности лекарственного средства на различных матрицах
Для получения информации о стабильности исследуемых соединений в различных органах и тканях организма, используется широкий спектр тест-систем in vitro: микросомы и/или фракция S9 печени, плазма крови, искусственный желудочный и кишечный соки.
Для сравнения метаболизма соединения между человеком и разными видами животных, используемых для проведения доклинических исследований, рекомендуется определение стабильности в выбранной матрице для нескольких видов.

Стоимость (1 вид, 1 исследуемое соединение):
Микросомы печени - 70 000 руб
S9 фракция печени - 80 000 руб
Плазма крови - 40 000 руб
Искусственный желудочный и кишечный соки - 80 000 руб

Описание метода →
2. Предсказание возможных метаболитов и путей метаболизма in vitro
Проведение анализа проб, полученных с использованием отобранных матриц, проводится методом ВЭЖХ-МС/МС с помощью специализированного программного обеспечения AB SCIEX Light Sight®, AB Analyst®. Определение возможных путей метаболизма, качественных и количественных характеристик предполагаемых метаболитов.

Стоимость(1 вид, 1 исследуемое соединение): 220 000 руб

Описание метода →
3. Пилотное исследование образования возможных метаболитов in vivo
Исследование проводится для подтверждения образования метаболитов.
По наличию соответствующих пиков в крови животных осуществляется качественное подтверждение метаболитов, определенных in vitro.

Модельные животные – мыши (всего не более 12 голов).

Стоимость(1 исследуемое соединение): 120 000 руб

Описание метода →
4. Синтез метаболитов
Проведение синтеза определенных метаболитов.
Предварительно оценивается возможность проведения синтеза, валидация схем синтеза.

Стоимость:
Валидация методики - от 30 000 руб
Синтез и контроль качества - от 30 000 руб

Подробнее →
5. Подтверждение образования возможных метаболитов in vitro и/или in vivo
Исследование проводится для подтверждения образования предсказанных и синтезированных метаболитов. Образование метаболита в выбранной матрице будет регистрироваться методом ВЭЖХ-МС/МС, разработанным на стандарте синтезированного метаболита.

Стоимость(1 исследуемое соединение): 250 000 руб

Описание метода →

По кинетике убыли тестируемого вещества в процессе инкубации рассчитывают:

> время полураспада (T1/2)
> клиренс in vitro (CLint)
> оставшееся количество вещества (% от начального)
> выбор матрицы, на которой соединение метаболизируется наиболее активно
ОБОРУДОВАНИЕ
Анализ проб проводится на масс-спектрометрах AB SCIEX QTRAP® 5500, AB SCIEX QTRAP® 6500.

Метаболизм соединения исследуют с помощью специализированного программного обеспечения AB SCIEX Light Sight®. Для поиска метаболитов пробу анализируют в режиме предсказательного MRM. Для поиска метаболитов не предсказанных AB SCIEX Light Sight® полученные метаболические образцы, а также контроль с веществом без кофактора, анализируют на масс-спектрометре с помощью программного обеспечения AB Analyst® в режимах сканирования Q1(полное сканирование с использованием первого квадруполя), MS2 (сканирование иона продукта) и MRM (мультиреактивный мониторинг).
ПО
AB Analyst®
AB SCIEX Light Sight®
Подробнее →
Приборы
AB SCIEX QTRAP® 5500
AB SCIEX QTRAP® 6500
Подробнее →
Матрицы
Микросомы печени (крыс, мышей, собак, обезьян, человека)
S9 фракция печени (крыс, собак, человека)
Биологические жидкости
Буферные растворы (рН=2, рН=4 и рН=7)
Подробнее →

Почему необходимо исследовать метаболиты малых молекул?

Попадая в организм, лекарственные препараты подвергаются биотрансформации посредством I и II фаз метаболизма. l фаза метаболизма - это этап биотрансформации, в ходе которого к молекуле соединения либо присоединяются полярные функциональные группы, либо осуществляется экспрессия таких групп, находящихся в субстрате в скрытой форме. Это достигается либо путем окисления или (значительно реже) восстановления молекул с помощью оксо-редуктаз, либо путем их гидролиза эстеразами и амидазами. Фаза ll - этап биологической конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, такими как глутатион, глюкуроновая кислота, сульфат и т.д.

Метаболиты, образуемые в реакциях I фазы, с большой вероятностью обладают химической реакционной способностью или фармакологической активностью. Образующиеся метаболиты лекарственных веществ могут обладать меньшей или большей активностью, чем сами лекарства. Некоторые пролекарства сами не активны, но в организме в процессе метаболизма превращаются в активные вещества.

Реактивные метаболиты соединяются ковалентными связями с макромолекулами, вызывая повреждение тканей. Связывание и взаимодействие реактивных метаболитов с различными терапевтическими биомишенями (ферментами, белками) приводит к возникновению нежелательных реакций. Лекарственные вещества и их метаболиты, образующиеся в результате реакций I фазы, могут быть недостаточно полярными для экскреции почками. Реакции конъюгации II фазы, как правило, приводят к образованию соединения с хорошей растворимостью в воде и не обладающего фармакологической активностью. Однако, подтверждение того, что метаболит фармакологически неактивен в отношении рецептора-мишени, не является гарантией отсутствия у него токсичности.

Рекомендации по исследованию метаболитов

Руководство FDA рекомендует проведение исследований профиля метаболитов in vitro на ранних стадиях разработки лекарств, так как метаболиты, которые являются уникальными для человека, могут потребовать дополнительных токсикологических исследований.
Ниже приведена схема по исследованию метаболитов малых молекул, предложенная FDA, с указанием соответствующих этапов работ, проводимых НИИ ХимРар.

Литературные источники:
FDA Guidance for Industry:Safety Testing of Drug Metabolites. (November 2016)
ICH Topic S 3 B: Pharmacokinetics: Repeated Dose Tissue Distribution Studies (June 1995)

Определение стабильности лекарственного средства на различных матрицах
Для получения информации о стабильности исследуемого соединения в различных органах и тканях организма, мы предлагаем широкий спектр тест-систем in vitro: микросомы и/или фракция S9 печени, кровь и плазму, искусственный желудочный и кишечный соки. Оценка стабильности в фракциях печени проводится в присутствии кофактора I фазы метаболизма (НАДФН) и/или с добавлением кофактора II фазы – конъюгации (УДФГК). Исследования проводятся на тканях человека и/или животных (мыши, крысы, собаки, обезьяны).

Дизайн исследования включает в себя:
> Исследование стабильности соединения в выбранных матрицах (микросомы и/или фракция S9 печени, кровь и плазму, искусственный желудочный и кишечный соки)
> Для сравнения метаболизма между человеком и разными видами животных, исследование может быть проведено в матрице нескольких видов (человек+мыши, крысы, собаки и/или обезьяны)
> Исследования стабильности в микросомах печени и S9 фракции печени может быть проведено в присутствии кофакторов 1 и 2 фазы метаболизма

По кинетике убыли тестируемого вещества в процессе инкубации рассчитывают:
> Время полураспада (T1/2)
> Клиренс in vitro (CLint)
> Оставшееся количество вещества (% от начального)


Полученные результаты позволят сравнить метаболизм исследуемого вещества у человека и животных и выбрать тип матриц для проведения дальнейших исследований.
Предсказание возможных метаболитов и путей метаболизма in vitro
Путем сопоставления данных о получаемых массах с известной структурой молекулы, проводится предсказание путей метаболизма препарата.

Дизайн исследования включает в себя:
> Постановка эксперимента с использованием отобранных матриц
> Подготовка и анализ проб методом ВЭЖХ-МС/МС

По результатам анализа определяют:
> Молярную массу и структуру метаболитов
> Реакции метаболизма
> Относительное количество тестируемого соединения и каждого метаболита во временных точках, %
Пилотное исследование возможных метаболитов in vivo
Исследование проводится для подтверждения образования предполагаемых метаболитов и определения основных фармакокинетических параметров.

Дизайн исследования включает в себя:
> Однократное дозирование животных
> Сбор и образцов крови
> Подготовка и анализ проб методом ВЭЖХ-МС/МС

Качественное подтверждение образования одного или нескольких предсказанных метаболитов in vitro по наличию соответствующих пиков в крови животных.
Идентификация цитохрома, отвечающего за метаболизм препарата

Цель данного исследования состоит в изучении вклада изоформ цитохрома 1А2, 3А4, 2С9, 2С19 и 2D6 в процесс метаболизма исследуемого препарата микросомами печени человека. Фенотипирование осуществляется путем селективного ингибирования этих ферментов специфическими препаратами: фурафиллином, кетоконазолом, сульфафеназолом, омепразолом и хинидином. Убыль тестируемого вещества в процессе 1 ч инкубации определяется с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа.

По кинетике убыли тестируемого вещества в процессе инкубации рассчитывают:
> Время полураспада (T1/2)
> Клиренс in vitro (CLint)
> Оставшееся количество вещества (% от начального)

По влиянию селективных ингибиторов на скорость исчезновения вещества делают вывод об изоформах CYP P450, преимущественно задействованных в метаболизме данного препарата.
Синтез метаболитов
Проведение синтеза предполагаемых метаболитов. Предварительно оценивается возможность проведения синтеза, валидация схем синтеза.

Количество: до 4 соединений, не менее 10 мг
Требования по качеству: 90%+ ЯМР/ ВЭЖХ

Подтверждение образования возможных метаболитов in vitro и/или in vivo
Образование метаболита в выбранной матрице (плазма крови, искусственные соки, фракции печени) будет регистрироваться методом ВЭЖХ-МС/МС, разработанным на стандарте синтезированного метаболита.

По кинетике убыли тестируемого вещества в процессе инкубации рассчитывают:
> Время полураспада (T1/2)
> Клиренс in vitro (CLint)
> Оставшееся количество вещества (% от начального)

Полученные результаты позволят сравнить метаболизм и сделать выводы об эффективности исходного соединения и синтезированных метаболитов.

При использовании проб, подготовленных на этапах 1-3, стоимость проведения исследования уменьшится.
Оборудование
Приборы AB SCIEX QTRAP® 5500, AB SCIEX QTRAP® 6500
Уникальный гибридный масс-спектрометр, который объединяет возможности лучшей системы с тройным квадруполем Triple Quad™ 5500 и новой инновационной технологии ионной ловушки Linear Accelerator™ Trap.

  • повышение чувствительности МС/МС сканирования до 100 порядков, при ультравысоких скоростях сканирования
  • повышение чувствительности до 100 раз в количественном анализе
  • обеспечение возможности использования масс-спектрометрии в комбинации с преимуществами ультраскоростной хроматографии
  • выполнение множественных экспериментов на одном приборе
  • TripleTrap™ позволяет переходить от чувствительных и специфичных режимов сканирования тройного квадруполя к высокочувствительному режиму ионной ловушки менее чем за одну миллисекунду
Оборудование
ПО Analyst®
Программа обработки МС и МС/МС данных, объединяющая прибор с ионными источниками и всеми компонентами системы ВЭЖХ в единый комплекс.

  • Возможность включения режима мониторинга множественных реакций (MRM) сканирования пары ионов в зависимости от времени элюирования конкретного вещества с хроматографической колонки.
  • Предварительное сканирование (pre scan) для более эффективной оценки и подсчета количества улавливаемых ионов, автоматически минимизирует возможность образования объёмного заряда и повышает качество масс спектров

ПО Light Sight®
Инструмент по прогнозированию, идентификации и подтверждению структуры метаболитов, разработке новых лекарственных препаратов и изучения схем их метаболизма в тканях и биологических жидкостях

  • Высокая степень достоверности полученных результатов
  • Подтверждение структуры потенциального метаболита по алгоритму ACD/MS ®
  • Автоматическое создание метода анализа
  • Автоматическое создание наиболее подходящего MRM перехода [М]+ / уникальный фрагмент
  • Мгновенное сравнение дефектов масс родительских и фрагментных
  • Определение типа возможных биотрансформаций (окисление, глюкуронирование и т. д.)
Оборудование
Матрицы
Микросомальная фракция печени (крыс, мышей, собак, обезьян, человека)
S9 фракция печени (крыс, собак, человека)

Микросомы печени – субклеточная фракция, содержащая основные метаболические ферменты, такие как цитохромы Р450, монооксигеназы, трансферазы. Доступность микросом, получаемых из печени различных видов млекопитающих, делает их одним из широко используемых средств для оценки метаболизма новых химических соединений: предсказание клиренса, возможных метаболитов, идентификация цитохромов, отвечающих за метаболизм исследуемого препарата. Использование пулированных микросом, полученных от нескольких доноров, позволяет исключить индивидуальную вариабельность. Свойства микросом хорошо охарактеризованы с использованием эталонных субстратов и воспроизводятся в разных партиях. Изучение метаболизма веществ в микросомальной фракции печени в присутствии кофактора I фазы метаболизма (НАДФН) или с добавлением кофактора II фазы – конъюгации (УДФГК)

S9 фракция печени содержит микросомы и цитозоль клеток с основными метаболическими ферментами как I, так и II фаз метаболизма: цитохромы Р450, флавин-монооксигеназы, альдегид оксидазы, глутатион трансферазы, моноамин оксидазы, УДФ (уридин 5 дифосфат-глюкоронозилтрансферазы) и другие. Доступность S9 фракций, получаемых из печени различных видов млекопитающих, делает их одним из широко используемых средств для оценки метаболизма новых химических соединений:предсказание клиренса, возможных метаболитов, идентификация цитохромов, отвечающих за метаболизм исследуемого препарата. При изучении стабильности в S9 фракции печени добавляется использование таких кофакторов, как УДФГК (уридиндифосфоглюкуроновая кислота) и ФАФС (3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат, PAPS) для расширенного исследования метаболизма фазы II.

Также возможно определение химической стабильности исследуемого препарата в различных буферах (рН=2, рН=4 и рН=7) и биологических жидкостях (плазма, искусственный желудочный сок).

    ДОКУМЕНТЫ

    Форма применимости ВЭЖХ-МС/МС
    Шаблон Договора
    Политика конфиденциальности
    Карточка компании НИИ ХимРар
    Сертификат ЦКП Сколково

    Отправить заявку

    или свяжитесь с нами по телефону +7 (495) 925-30-74 (521)
    Ваше имя, наименование компании *
    Телефон
    Email *
    Укажите Ваш e-mail для уточнения информации о запросе
    Доп. файлы
    Форма применимости ВЭЖХ-МС/МС
    Нажимая кнопку «Заказать», Вы подтверждаете начало обработки Вашего запроса
    Все права защищены © 2019 ЦВТ "ХимРар"
    Структурная идентификация метаболитов методами LC-MS/MS
    141401, г. Химки, ул. Рабочая, д. 2а, корп. 1